Retornando da capital francesa, o médico reassumiu o cargo na Policlínica Geral e juntou-se à comissão de Eduardo Chapot-Prévost para estudar a mortandade de ratos que gerou surto de peste bubônica em Santos. De volta ao Rio de Janeiro, assumiu a direção técnica do Instituto Soroterápico Federal. A instituição, sob o comando do proprietário do Instituto Vacínico Municipal, foi fundada em 1900. Demonstrou que a epidemia era incontrolável sem o emprego do soro adequado.  A cidade era uma das mais sujas do mundo, grande parte da população vivia em cortiços. Dezenas de doenças se proliferavam na população da cidade de forma epidêmica, como a febre amarela, a peste bubônica e a varíola.

 

Dois anos depois, o jovem bacteriologista assumiu a direção do Instituto e trabalhou para ampliar suas atividades para além da fabricação de soro antipestoso, incluindo a pesquisa básica aplicada e a formação de recursos humanos. No ano seguinte, chegou ao comando da Diretoria-Geral de Saúde Pública (DGSP).

 

O jovem médico e cientista teve que empreender uma campanha sanitária de combate às principais doenças da capital federal: febre amarela, peste bubônica e varíola. Para isso, adotou métodos como o isolamento dos doentes, a notificação compulsória dos casos positivos, a captura dos vetores – mosquitos e ratos –, e a desinfecção das moradias em áreas de focos. Utilizando o Instituto Soroterápico Federal como base de apoio técnico-científico, deflagrou campanhas de saneamento e, em poucos meses, a incidência de peste bubônica diminuiu com o extermínio dos ratos, cujas pulgas transmitiam a doença. Organizou os batalhões de "mata-mosquitos", encarregados de eliminar os focos dos insetos transmissores.

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Ao combater a febre amarela, na mesma época, Oswaldo Cruz enfrentou vários problemas. Grande parte dos médicos e da população acreditava que a doença se transmitia pelo contato com as roupas, suor, sangue e secreções de doentes. No entanto, Oswaldo Cruz acreditava em uma nova teoria: o transmissor da febre amarela era um mosquito. Assim, suspendeu as desinfecções, método tradicional no combate à moléstia, e implantou medidas sanitárias com brigadas que percorreram casas, jardins, quintais e ruas, para eliminar focos de insetos. Sua atuação provocou violenta reação popular. Organizou os batalhões de "mata-mosquitos", encarregados de eliminar os focos dos insetos transmissores.

 

Em 1904, a oposição a Oswaldo Cruz atingiu seu ápice. Com o recrudescimento dos surtos de varíola, o sanitarista tentou promover a vacinação em massa da população. Os jornais lançaram uma campanha contra a medida ,consideram uma invasão de suas casas e uma vacinação forçada, o que ficou conhecido como Revolta da Vacina. O congresso protestou e foi organizada a Liga contra a vacinação obrigatória. No dia 13 de novembro, estourou a rebelião popular e, no dia 14, a Escola Militar da Praia Vermelha se levantou. O Governo derrotou a rebelião, que durou uma semana, mas suspendeu a obrigatoriedade da vacina. Mesmo assim, em 1907, a febre amarela estava erradicada do Rio de Janeiro. Em 1908, em uma nova epidemia de varíola, a própria população procurou os postos de vacinação.

 

Apesar da crise, entre 1905 e 1906, Oswaldo Cruz empreendeu uma expedição a 30 portos marítimos e fluviais de Norte a Sul do país para estabelecer um código sanitário com regras internacionais. A luta contra as doenças ganhou reconhecimento internacional em 1907, quando Oswaldo Cruz recebeu a medalha de ouro no 14º Congresso Internacional de Higiene e Demografia de Berlim, na Alemanha, pelo trabalho de saneamento do Rio de Janeiro. Oswaldo Cruz ainda reformou o Código Sanitário e reestruturou todos os órgãos de saúde e higiene do país.

Em 1908 o sanitarista foi recepcionado como herói nacional e, no ano seguinte, o instituto passou a levar seu nome. Com a equipe do Instituto Oswaldo Cruz (IOC) fez o levantamento das condições sanitárias do interior do país. Em 1910 combateu a malária durante a construção da Ferrovia Madeira-Mamoré (viajou a Rondônia com Belisário Penna), e a febre amarela, a convite do governo do Pará.

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Em 1909, deixou a Diretoria Geral de Saúde Pública, passando a se dedicar apenas ao Instituto de Manguinhos, que fora rebatizado com o seu nome. Do Instituto lançou importantes expedições científicas que possibilitaram a ocupação do interior do país. Erradicou a febre amarela no Pará e realizou a campanha de saneamento da Amazônia. Permitiu, também, o término das obras da Estrada de Ferro Madeira-Mamoré, cuja construção havia sido interrompida pelo grande número de mortes entre os operários, provocadas pela malária.

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 Em 1915, por motivos de saúde, abandonou a direção do Instituto Oswaldo Cruz e mudou-se para Petrópolis. Eleito prefeito daquela cidade, traçou vasto plano de urbanização, que não pode ver construído. Sofrendo de crise de insuficiência renal, morreu a 11 de fevereiro de 1917, com apenas 44 anos.